ССЛЕДОВАНИЕ КОМБИНИРОВАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
ВИРАЗОЛА И ВОДНОГО РАСТВОРА СО СТАБИЛИЗИРОВАННЫМ ОТРИЦАТЕЛЬНЫМ
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫМ ПОТЕНЦИАЛОМ (ВРСО ОВП) НА ИНФЕКЦИОННЫЕ
СВОЙСТВА ВИРУСА ГЕПАТИТА С (ВГС)
ОТЧЕТ
Введение
Проведенные нами ранее исследования противовирусной активности водного
раствора со стабилизированным отрицательным
окислительно-восстановительным потенциалом (далее по тексту - ВРСО ОВП)
на инфекцию вызванную вирусом гепатита С в культурах клеток позволили
получить данные, свидетельствующие о том, что:
- ВРСО ОВП не обладает цитотоксическими свойствами для культур клеток СПЭВ в течение 4 и более дней культивирования;
- ВРСО ОВП обладает высокой вирулицидной активностью в отношении вируса
гепатита С при экспозиции ВГС-содержащей жидкости и среды Игла,
приготовленной на ВРСО ОВП, в течение 1 и особенно 24 часов, когда
выявить инфекционную активность ВГС в культурах клеток СПЭВ не
удавалось;
- ВРСО ОВП обладает противовирусными свойствами и способен снижать
продукцию ВГС инфицированными клетками в среднем на 3,0 – 4,0 lg при
добавлении его сразу же после адсорбции ВГС на клетки.
Представляло интерес изучить влияние ВРСО ОВП на инфекционные свойства
ВГС при комбинированном его применении в условиях острой инфекции,
вызванной ВГС в культурах клеток СПЭВ.
Материал и методы
В работе использовали цитопатогенный штамм вируса гепатита С (ВГС),
относящийся к генотипу 1b. Штамм был выделен из сыворотки крови больной
хроническим вирусным гепатитом С, идентифицирован как вирус гепатита С.
В работе использовали инфекционные дозы ВГС, равные 10,0 ТЦД 50/20 мкл.
Были использованы высоко чувствительные к цитопатогенному действию ВГС
культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), полученные
из лаборатории экологии вирусов ГУ НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского
РАМН. Их использовали в виде однодневного монослоя клеток, выращенного
в 24-луночных пластиковых панелях. Культуры клеток СПЭВ выращивали на
среде 199 10-процентной сыворотки эмбриона телят с добавлением
глютамина и антибиотиков (100 ЕД/мл). Для титрования остаточной
инфекционности вируса использовали ту же перевиваемую линию клеток
(СПЭВ). Водный раствор со стабилизированным отрицательным
окислительно-восстановительным потенциалом (ВРСО ОВП) был предоставлен
в виде стерилизованной бесцветной прозрачной жидкости в стеклянных
емкостях. В исследовании использовали только что открытую бутылку,
содержащую ВРСО ОВП. Перед началом опыта все варианты ВРСО ОВП
использовали для приготовления питательной среды, осторожно
вращательными движениями флакона в горизонатльном положении растворяли
2 г сухой среды Игла (фирма Hy Clone), после полного растворения жидкую
среду фильтровали медленно, чтобы фильтрат слоился по стенке пробирки.
Затем осторожно к фильтрату добавляли 7% сыворотки эмбриона телят,
антибиотики. Эта среда, содержащая ВРСО ОВП, служила как средой
поддержки, так и питательной средой для инфицированных и
неинфицированных культур клеток. В опытах использовали растворы ВРСО
ОВП на питательной среде в соотношении 9 частей ВРСО ОВП и 1 часть
обычной питательной среды, 1 часть ВРСО ОВП и 100 частей питательной
среды. В качестве контрольного опыта использовали те же культуры клеток
и вирус, которые выращивали на среде, не содержащей ВРСО ОВП. Для
оценки комбинированного действия ВРСО ОВП использовали коммерческий
препарата виразол (рибавирин), который применяется для лечения
вирусного гепатита С. Препарат применяли в концентрации 100,0 и 50,0
мкг/в 100 мкл. Изучение противовирусной активности ВРСО ОВП и виразола
Противовирусную активность ВРСО ОВП и виразола исследовали в культурах
клеток СПЭВ по данным изучения а) жизнеспособности инфицированных
клеток, выращиваемых на обычной среде и среде, содержащей ВРСО ОВП, б)
по концентрации инфекционного вируса, продуцируемого клетками,
выращиваемых на обычной среде, на среде с ВРСО ОВП, на среде с
виразолом и на среде с ВРСО ОВП + виразол.
Результаты
Как видно из данных табл.1.,
в ВГС инфицированных культурах, не обработанных препаратами (контроль
ВГС – инфекции) уже через 48 часов после заражения наблюдалась гибель
50-60% клеток, в то время как к этому же сроку в культурах клеток,
обработанных виразолом в концентрации 100 мкг/в 0,1мл, каких-либо
явлений вирусиндуцированной гибели клеток не наблюдали. Несколько иная
картина наблюдалась через 72 часа после заражения клеток. Когда виразол
вводили за 1 час до заражения клеток 5-10% ВГС инфицированных клеток
погибало при внесении виразола сразу же после адсорбции вируса, а через
1 час после инфекции наблюдали гибель 65% клеток. Культивирование ВГС
инфицированных клеток в присутствии ВРСО ОВП давало несколько отличные
результаты, а именно: к 48 часам после заражения фактически все
инфицированные клетки выживали во всех 3-х вариантах опыта, а к 72
часам после инфекции 45 и 25% ВГС инфицированных клеток погибало, когда
ВРСО ОВП вносили сразу после адсорбции вируса или через 1 час после
заражения клеток соответственно. Данные табл.1 свидетельствуют о том,
что антивирусный эффект при комбинированном применении двух препаратов
(виразол и ВРСО ОВП) в значительной мере усиливается, что приводит к
100% выживаемости ВГС инфицированных клеток во всех вариантах опыта.
Следует также отметить, что в ВГС инфицированных культурах клеток СПЭВ,
обработанных виразолом в концентрации 100 мкг, отмечали зернистость и
другие изменения морфологии, характерные при интоксикации, в то время
как в клеточных культурах, где использовали комбинацию виразол (100
мкг/мл) + ВРСО ОВП, клетки СПЭВ внешне не отличались от контрольных
(необработанных препаратом) культур. Титрование проб, отобранных из ВГС
инфицированных культур клеток через 48 часов после инфекции, показало,
что выжившие культуры клеток, обработанные в разные сроки ВГС инфекции
виразолом, ВРСО ОВП или ВРСО ОВП в комбинации с виразолом, не
продуцировали инфекционного вируса, в то время как в пробах среды,
отобранных из контрольных ВГС инфицированных культур к этому времени
ВГС накапливался в инфекционных титрах до 4,0 lg ТЦД50/0,1 мл.
Следующие серии опытов были направлены на изучение возможности
комбинированного действия двух препаратов на инфекцию, вызванную ВГС, в
случае, когда виразол использовали в концентрации 50 мкг/мл, не
вызывающей цитотоксического эффекта в клетках. Полученные результаты
приведены в табл.2. Показано, что виразол в этой концентрации также
обладает противовирусной активностью, приводя к 90-100% выживаемости
ВГС инфицированных клеток, причем титры вируса снижались до 0, когда
виразол добавляли за 1 час до заражения клеток, и на 2,5 – 3,0 lg в
случае использования препарата сразу же после заражения клеток или
через 1 час после инфекции.
ВРСО ОВП, как и прежде, к 48 часам после инфекции
полностью защищал ВГС инфицированные клетки от цитопатогенного действия
вируса. В этих условиях мы не наблюдали и содержание инфекционного
вируса в пробах среды, отобранных из инфицированных культур клеток. В
контрольных, не обработанных препаратами культурах клеток СПЭВ + ВГС к
48 часам после заражения до 50% клеток погибало. При использовании
комбинированного действия препаратов ВРСО ОВП и виразола ВГС инфекция к
48 часам не приводила к гибели инфицированных клеток или к продукции
вируса в питательную среду.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Обнаружены противовирусные
свойства препарата виразол (рибавирин) в концентрации 100 мкг/0,1 мл
через 48 часов после заражения клеток СПЭВ ВГС; через 72 часа после
заражения клеток противовирусные свойства препарата виразол снижались,
особенно когда виразол вводили через 1 час после инфекции.
2. ВРСО ОВП к 48 часам после заражения приводил к выживанию 100%
клеток, в то время как в контроле погибало 50-60% ВГС инфицированных
клеток; к 72 часам после инфекции 45 и 25% ВГС инфицированных клеток
погибало, когда ВРСО ОВП вносили сразу после адсорбции вируса или через
1 час после заражения клеток соответственно.
4. Антивирусный эффект при комбинированном применении двух препаратов в
значительной мере усиливается, что приводит к 100% выживаемости ВГС
инфицированных клеток во всех вариантах опыта.
5. При использовании комбинированного действия препаратов ВРСО ОВП и
виразола в концентрации 50 мкг/0,1 мл ВГС инфекция к 48 часам не
приводила к гибели инфицированных клеток или к продукции вируса в
питательную среду.
Табл.1 ВЛИЯНИЕ ВИРАЗОЛА В КОМБИНАЦИИ С ВРСО ОВП НА ИФЕКЦИОННЫЕ СВОЙСТВА ВГС В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК
|
Обработка культур клеток
|
Жизнеспособность ВГС инфицированных культур клеток СПЭВ (в %)
|
|
Виразол (100 мкг/мл)
|
ВРСО ОВП
|
Виразол
(100 мкг/млд)
+ВРСО ОВП
|
Без препаратов
|
|
48 часов
|
72 часа
|
48 часов
|
72 часа
|
48 часов
|
72 часа
|
48 часов
|
72 часа
|
|
За 1 час до заражения клеток
|
100
|
100
|
100
|
100
|
100
|
100
|
50
|
0
|
|
Сразу после адсорбции вируса
|
100
|
90
|
100
|
55
|
100
|
100
|
45
|
0
|
|
Через 1 час после заражения
|
100
|
35
|
95
|
75
|
100
|
100
|
40
|
0
|
Табл.2 ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ВИРАЗОЛА В КОНЦЕНТРАЦИИ 50мкг/мл В
КОМБИНАЦИИ С ВРСО ОВП ПРИ ИФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВГС В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК
СПЭВ (48 часов после заражения).
|
Обработка культур клеток
|
Инфекционные титры ВГС (lgТЦД50 \0,1 мл) в пробах среды, отобранных из культур клеток СПЭВ (в %)
|
|
Виразол (100 мкг/мл)
|
ВРСО ОВП
|
Виразол
(100 мкг/млд)
+ВРСО ОВП
|
Без препаратов
|
|
1*
|
2**
|
1
|
2
|
1
|
2
|
1
|
2
|
|
За 1 час до заражения клеток
|
100
|
0
|
100
|
0
|
100
|
0
|
55
|
4,8
|
|
Сразу после адсорбции вируса
|
90
|
2,5
|
100
|
0
|
100
|
0
|
50
|
5,0
|
|
Через 1 час после заражения
|
95
|
2,0
|
100
|
0
|
100
|
0
|
45
|
5,0
|
*1 - % жизнеспособных клеток
** 2 – титр ВГС в пробах сред
|
