ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ВОДНОГО РАСТВОРА СО СТАБИЛИЗИРОВАННЫМ ОТРИЦАТЕЛЬНЫМ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫМ ПОТЕНЦИАЛОМ (ВРСО ОВП) ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ПАТОГЕННЫМ ВАРИАНТОМ ВИРУСА ПТИЧЬЕГО ГРИППА A (H5N1) В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК
ОТЧЕТ

Появление в Новосибирской области Российской Федерации патогенного для птиц вируса гриппа А птиц (H5N1) и дальнейшее его распространение по многим областям и регионам Российской Федерации представляет реальную угрозу сельскому хозяйству России, в частности, для птицеводческих ферм страны. Кроме того, возрастает реальная угроза появления нового пандемического штамма вируса гриппа человека. Как свидетельствуют наши данные, существующие противогриппозные средства в полной мере не могут обеспечить эффективного лечения больных гриппом. Что касается инфицированных патогенными штаммами вируса гриппа А птиц, то в России до сих пор на практике не использовали каких-либо средств лечения. Представляется важным проводить поиск новых эффективных препаратов для лечения и профилактики гриппа у птиц, которые могут оказаться эффективными и в отношении инфекции, вызванных ожидаемым пандемическим штаммом.
Материал и методы
Штамм вируса гриппа птиц А (H5N1). В работе использовали высоко патогенный штамм вируса гриппа птиц А (H5N1), выделенный нами от умершей домашней курицы в Новосибирской области во время эпизоотии в июле 2005 года. Штамм вируса гриппа оказался высоко патогенным для культур клеток почки эмбриона свиньи (линия клеток СПЭВ), инфекция в которых сопровождалась развитием интенсивного цитопатического эффекта. В работе использовали инфекционные дозы вируссодержащего материала, равные 10,0ТЦД50/0,2 мл. Исследования противовирусной активности ВРСО ОВП проводили в культурах клеток СПЭВ, выращенных в виде однодневного монослоя в 48-луночных панелях на питательной среде 199 с добавлением 10% сыворотки эмбриона телят и антибиотиков. Препарат ВРСО ОВП был передан для исследования в герметически закрытых флаконах в виде светлой прозрачной жидкости. Перед началом опыта все варианты ВРСО ОВП использовали для приготовления питательной среды, осторожно вращательными движениями флакона в горизонатльном положении растворяли 2 г сухой среды Игла (фирма Hy Clone), после полного растворения жидкую среду фильтровали медленно, чтобы фильтрат слоился по стенке пробирки. Затем осторожно к фильтрату добавляли 7% сыворотки эмбриона телят, антибиотики. Эта среда, содержащая ВРСО ОВП, служила как средой поддержки, так и питательной средой для инфицированных и неинфицированных культур клеток. В опытах использовали растворы ВРСО ОВП на питательной среде в соотношении 9 частей ВРСО ОВП и 1 часть обычной питательной среды, 1 часть ВРСО ОВП и 100 частей питательной среды. В качестве контрольного опыта использовали те же культуры клеток и вирус, который выращивали на среде, не содержащей ВРСО ОВП. Использование вышеупомянутой дозы вируса гриппа позволяло учитывать окончательный результат через 24 и 96 часов после инфекции. Результаты исследований учитывали по влиянию препаратов на жизнеспособность инфицированных гриппом клеток СПЭВ в сравнении с контрольными опытами, в которых использовали только зараженные вирусом птичьего гриппа А культуры клеток, культуры клеток интактные и культуры клеток, обработанные препаратами.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследования по изучению влияния ВРСО ОВП на жизнеспособность культур клеток СПЭВ, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1 показали, что оптимальным противовирусным действием препарат ВРСО ОВП обладал в случае внесения его в культуры клеток за 1 час до заражения вирусом. От 80% до 100% клеток СПЭВ, инфицированных вирусом H5N1, в течение 48 часов от момента заражения сохраняли жизнеспособность, в то время как контрольные (необработанные ВРСО ОВП) культуры клеток полностью погибали в течение этого времени (табл.1). Добавление питательной среды, приготовленной на основе ВРСО ОВП сразу же после адсорбции вируса способствовало сохранению 25 % процентов инфицированных клеток, а внесение ВРСО ОВП в культуры клеток через 1 час после заражения не приводило к появлению устойчивости инфицированных клеток к цитопатогенному действию вируса. Представляло интерес изучить противовирусное действие ВРСО ОВП в более близкие сроки после заражения вирусом гриппа птиц. С этой целью пробы культуральной среды отбирали через 24 часа после заражения вирусом, когда отчетливых явлений цитодеструкции не было выявлено. Полученные данные представлены в табл.2. Показано, в частности, что обработка культур клеток ВРСО ОВП за 1 час до заражения к 24 часам приводила к снижению продукции вируса на 4,5 lg. Если же ВРСО ОВП вносили после адсорбции вируса или через 1 час после заражения культур клеток СПЭВ, то противовирусный эффект препарата снижался и составлял 2,5 -3,0 lg. Как видно из данных, представленных в табл. 2, через 72 часа после заражения антивирусный эффект ВРСО ОВП в определенной степени сохранялся лишь в случае обработки клеток СПЭВ за 1 час до заражения вирусом, когда происходило 100-кратное снижение продукции вируса инфицированными клетками. Внесение ВРСО ОВП сразу же после адсорбции вируса или через 1 час после заражения не дало положительных результатов к 72 часам после инфекции.
Заключение
1. Обнаружено противовирусное действие водного раствора со стабилизированным отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом (ВРСО ОВП) на инфекционные свойства вируса гриппа А/H5N1 птиц.
2. Оптимальным противовирусным действием препарат ВРСО ОВП обладал в случае внесения его в культуры клеток за 1 час до заражения вирусом.
3. Противовирусная активность препарата ВРСО ОВП, внесенного за 1 час до заражения клеток сохранялась до 72 часов после заражения культур клеток вирусом гриппа А/H5N1, в то время как препарат был активен только в ранние сроки после инфекции в случае обработки клеток в момент инфицирования или через 1 час после заражения.
Табл.1 Влияние ВРСО ОВП на жизнеспособность культур клеток СПЭВ, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1.

Табл.2 Влияние ВРСО ОВП на инфекцию, вызванную вирусом гриппа А/H5N1 в культурах клеток СПЭВ (24 часа после заражения клеток)