«УТВЕРЖДАЮ»
от «Исполнителя»
Директор ГУ НИИ вирусологии
им. Д.И. Ивановского РАМН
академик РАМН

ОТЧЕТ
о выполнении работ по теме
«Исследование противовирусной активности напитка «Ваше здоровье»
на модели герпесвирусной инфекции in vivo»
оставлен 22 апреля 2004 г.
Исследование противовирусной активности препаратов проведено сотрудниками лаборатории
сравнительной вирусологии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН:
1. Баринский И.Ф. – профессор., д.м.н., зав.лаб.
2. Алимбарова Л.М. – доцент, к.м.н., с.н.с.
3. Мельников В.Р. – научный сотрудник
4. Бусуек И.Н. – лаборант-исследователь
5. Рудик С.В. – лаборант-исследователь
Наименование темы:
«Исследование противовирусной активности напитка «Ваше здоровье» на модели герпесвирусной
инфекции in vivo».
Исследование противовирусной активности напитка «Ваше здоровье»
проведено в лаборатории сравнительной вирусологии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.
Список сокращений
ВПГ-1 – вирус простого герпеса типа 1;
ВПГ-1 – вирус простого герпеса типа 2;
ОВП – окислительно-восстановительный потенциал;
ГГ – генитальный герпес;
ГИ – герпесвирусная инфекция;
ТЦД – тканевая цитопатическая доза;
ЛД – летальная доза;
ИЛД – индекс лечебного действия;
ИН – индекс нейтрализации;
СИВС – суммарный индекс выраженности симптоматики;
ГИ – герпетическая инфекция;
СПЗ – средняя продолжительность заболевания;
ЦНС – центральная нервная система.
Введение
Генитальный герпес (ГГ) — одна из разновидностей инфекционного заболевания, вызываемого ВПГ-2 или, в меньшей степени, ВПГ-1, и, характеризующегося появлением герпетических высыпаний и эрозий в области половых органов. ГГ относится к наиболее распространенным заболеваниям, передающимся половым путем. По данным британского исследования, 23% взрослых лиц, обращающихся в венерологические клиники, и 7,6% доноров крови в Лондоне имеют антитела к ВПГ-2. Всего же, в Великобритании зарегистрировано около 200 000 больных герпесом половых органов, причем число новых случаев возрастает ежегодно более чем на 10%. Аналогичная картина имеется и в Российской Федерации. Различают следующие типы ГГ: первый эпизод первичной инфекции — выявление ВПГ в тех случаях, когда в анамнезе отсутствуют указания на наличие антител к ВПГ-1 или ВПГ-2; первый эпизод вторичной инфекции — выявление ВПГ-2 в тех случаях, когда в анамнезе имеются указания на наличие антител к ВПГ-1, первый рецидив первичной инфекции — выявление ВПГ-2 (или ВПГ- 1) в тех случаях, когда в анамнезе имеются указания на наличие соответствующих антител; рецидивирующая инфекция — периодическая активация латентной инфекции. При первичной инфекции гениталий ВПГ поднимается от места инокуляции по периферическим нервам эндоневрально, интраневрально, интрааксонально или по шванновским клеткам до спинальных и церебральных ганглиев (или достигает их вследствие вирусемии, где и остается "спящим" и неуязвимым для противовирусных атак). При реактивации вирус длительно мигрирует по периферическим нервам, вызывая раздражение нервных окончаний, приводя к продромальным ощущениям типа кожного жжения или зуда, предшествующим появлению везикулезных высыпаний. При достижении вирусом поверхности кожи или слизистых оболочек развивается либо выраженный рецидив, либо бессимптомная форма заболевания. Рецидивы ГГ могут встречаться на фоне высоких уровней циркулирующих антител, т.к. ВПГ распространяется внутри нервной ткани, переходя от одной клетки к другой, избегая контакта с антителами. Вирус-нейтрализующие антитела, хотя и препятствуют распространению инфекции, но не предупреждают развития рецидивов. Механизм рецидивов ГГ до конца не ясен, но имеет место ряд факторов, обусловливающих обострение латентной вирусной инфекции: предменструальный период; усталость, стресс; иммунодефицитные состояния различного генеза; сексуальный контакт или другое раздражающее механическое или химическое воздействие в области наружных половых органов; интеркуррентная инфекция и т.д. Наиболее распространенным способом инфицирования половых органов – является прямой контакт с инфицированными выделениями, причем заражение может происходить от инфицированного пациента, как при наличии симптомов заболевания, так и при их отсутствии. Инкубационный период первичного герпеса половых органов колеблется от 2 до 12 дней, в среднем - 7 дней. Локализация поражений на половых органах определяется входными воротами инфекции. Кожные покровы, слизистые оболочки наружных гениталий и влагалища являются входными воротами для ВПГ-2. Герпетические поражения половых органов у мужчин могут локализоваться на крайней плоти, головке, теле полового члена или перианально. Герпетические поражения женских половых органов могут находиться на половых губах, клиторе, промежности, во влагалище или перианальной области. Возможны поражения шейки матки в виде диффузного воспаления с эрозиями, больших изолированных язв или обширных некротических изъязвлений. При первичной инфекции высыпания часто имеют множественную локализацию, сопровождаются увеличением и болезненностью паховых лимфоузлов. Длительность острого периода при первичном ГГ может достигать 3-5 недель. В ряде случаев инфицирование протекает скрытно, переходя сразу в латентный период. При рецидивирующей инфекции развитию рецидива, как правило, предшествует период “продромы”. Продромальная фаза, включающая зуд, жжение или кожную гиперчувствительность в местах последующих поражений, наблюдается приблизительно у половины больных с рецидивирующим ГГ. У 75% больных продромальная фаза продолжается более 24 часов. Имеется значительная вариабельность в клиническом течении рецидивов у различных больных и даже различных атак у одного и того же больного. Диагноз ГГ ставится на основании результатов вирусологических и серологических исследований. Лечение ГГ представляет большие трудности. Цель настоящих исследований: изучение противовирусной активности напитка «Ваше здоровье» на модели первичной герпесвирусной инфекции гениталий у морских свинок. Материалы и методы
Вирус
В качестве тест-вируса использовали вирус простого герпеса (ВПГ), 2-го антигенного типа, штамм ВН, в виде вируссодержащей взвеси с инфекционным титром 5,0-5,5 lg ТЦД50/мл. Вирус поддерживали в серийных пассажах и титровали на перевиваемой культуре клеток почек зеленых мартышек VERO в среде Игла, содержащей 2% сыворотки эмбрионов телят, глутамин и антибиотики. Титр вируса оценивали (в lg ТЦД 50 /мл) по стандартной методике (по Риду и Менчу). ВПГ-2, штамм ВН, получен из лаборатории музейных штаммов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Культура клеток
В работе использовали культуру клеток почек зеленых мартышек, полученную из лаборатории культур тканей ГУ НИИ вирусологии РАМН. Клетки культивировали в среде роста, представляющей собой среду ИГЛА с добавлением 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мМ L -глутамина и антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Среда поддержки содержала все указанные выше ингредиенты и 2% ТС. Клетки выращивали в культуральных флаконах или планшетах (фирмы «С ostar », Великобритания) и инкубировали в термостате в атмосфере 5% СО 2 при +37oС. Животные
В работе использовали самцов морских свинок, массой 250- 300 г ., полученных из питомника РАМН “Столбовая”. Животных содержали в стандартных условиях вивария на стандартном рационе при свободном доступе к воде и пище Моделирование инфекции
Самцов морских свинок заражали культуральной, вируссодержащей жидкостью (ВПГ-2,"ВН") по стандартной методике (1,2). Вируссодержащую жидкость (в дозе 100 ЛД 50/0,1 мл) наносили с помощью пипетки (с последующим втиранием) на предварительно скарифицированную кожу penis (a). Скарифицирование проводили с помощью хирургического ланцета, после того как животные были анестезированы лидокаином (спрей). Размер площади скарификации составлял 4-7 мм. Для определения тяжести инфекционного процесса в каждой группе использовали метод бальной оценки. Тяжесть инфекционного процесса оценивали ежедневно перед проведением лечения и прослеживали в течение всего периода болезни по следующим параметрам: площадь и степень специфических поражений; наличие отека, гиперемии, орхита. Максимальная выраженность каждого признака составляла 4 балла. Визуальное наблюдение за животными проводили в течение 24 дней. Препараты и схемы введения
Проведено сравнительное исследование напитка «Ваше здоровье» (далее «напиток») и таблетированной формы антивирусного референс-препарата Zovirax, cодержащего ацикловир (9-(2-гидроксиэтоксиметил) гуанин) производства фирмы G laxo-Wel l come Operations , Великобритания. Напиток «Ваше здоровье» был представлен ООО «Редокс технологии» (Россия, г.Москва) в стеклянных флаконах, наполненных «до краев», емкостью 200 мл. Напиток представляет собой слегка сладковатую жидкость без цвета и запаха с отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом. Исследование напитка осуществляли в соответствии с рекомендациями Заказчика. Напиток исследовали по лечебной схеме при пероральном способе введения в объеме 1,5 мл/животное 3 раза в сутки в течение 7 дней. Таблетированную форму препарата Zovirax непосредственно перед использованием гомогенизировали в ступке, растворяли в физиологическом растворе и в виде взвеси перорально вводили животным с помощью шприца со специальной насадкой. Препарат Zovirax вводили с учетом веса животного в дозе 100 мг/кг/день в объеме 1 мл. В качестве плацебо использовали стерильный физиологический раствор. Лечение с использованием напитка «Ваше здоровье», плацебо и референс-препарата Zovirax начинали через 48 часов после инфицирования, при достаточно выраженных проявлениях болезни, и проводили ежедневно 3 раза в сутки, в течение 7 дней. Эффективность препаратов в каждой группе оценивали на пике выраженности патологического процесса по стандартной методике. Критериями оценки лечебного действия препаратов в опытных группах по сравнению с контрольной являлись: уменьшение выраженности клинической симптоматики, индекс лечебного действия (ИЛД), сокращение продолжительности заболевания (в сутках), предотвращение летального менингоэнцефалита.
Достоверность различий между группами оценивали с помощью критерия Стьюдента.
сумма баллов - сумма баллов в группе животных,
в контроле получавших препарат
ИЛД (в %) = ------------------------------------------------------------ х 100
сумма баллов в контроле
Описание исследуемых групп
Напиток «Ваше здоровье» исследовали по лечебной схеме при пероральном способе введения. С учетом цели эксперимента все животные были разбиты на 3 группы, по 5 особей в каждой. Первая группа содержала только инфицированных ВПГ-2 животных, которым вводили перорально физиологический раствор (контроль инфицирования). Вторая группа содержала инфицированных животных, которым вводили перорально напиток в объеме 1,5 мл. Третья группа содержала инфицированных ВПГ-2 животных, которым вводили перорально препарат Zovirax в объеме 1 мл. Лечение зараженных ВПГ-2 морских свинок начинали через 48 часов после инфицирования при наличии достаточно выраженных проявлений болезни. Препараты вводили 3 раза в сутки, ежедневно в течение 7 дней. Изучение гуморального иммунитета проводили в реакции нейтрализации (РН) in vitro на перевиваемой клеточной культуре клеток зеленых мартышек (VERO) по стандартной методике. В экспериментах использовали двухдневный монослой культуры клеток VERO, выращенный в 24- луночных панелях для культивирования клеток фирмы Costar. Посевная доза клеток составила 4-5х10 5 кл/мл, объем вносимой суспензии - 1 мл/лунка. Для выращивания культуры клеток VERO использовали среду роста, состоящую из среды ИГЛА с добавлением 10% сыворотки эмбрионов телят, глютамина, антибиотиков (100 мкг/мл стрептомицина + 100 ед/мл пенициллина). В качестве поддерживающей среды применяли питательную среду ИГЛА с добавлением 2% сыворотки эмбрионов телят, глютамина и антибиотиков. Планшеты с культурой клеток содержали в термостате с 5 % СО 2, 98% влажностью при температуре 37oС. Непосредственно до инфицирования и на 14-е сутки после инфицирования забирали кровь от каждой особи, входящей в опытные и контрольную группы, затем пробы объединяли. Непосредственно перед постановкой реакции исследуемые сыворотки прогревали в течение 30 мин. при +56oС в водяной бане в соответствии с общепринятыми рекомендациями. В качестве тест-вируса использовали ВПГ-2, штамм ВН, с активностью 5,0-5,5 Lg ТЦД50/0,1 мл. В качестве стандартной референтной сыворотки использовали сыворотку не инфицированных морских свинок. Неразведенные опытные и референтную сыворотки соединяли с десятикратными разведениями вируса, приготовленными на среде ИГЛА с добавлением 100 мкг/мл стрептомицина и 100ед/мл пенициллина, в равных объемах (по 0,4 мл каждого компонента), инкубировали в термостате при +37oС в течение 60 минут. Затем смесь вносили в культуру клеток VERO, предварительно освобожденную от ростовой среды, трижды отмытую раствором Хенкса, и инкубировали в термостате при +37oС в течение 45 минут. Не связавшийся инокулят удаляли, клетки трижды отмывали раствором Хенкса и добавляли среду поддержки. Ежедневно, в течение 96 ч. при помощи инвертированного микроскопа изучали вирусное цитопатическое действие и рассчитывали титр вируса. Титр вируса определяли по стандартной методике и выражали в lg ТЦД50 (доза, инфекционная для 50% зараженных клеток). Разницу титров вируса в присутствии референтной сыворотки и титров, полученных после нейтрализации вируса опытными сыворотками, считали показателем вируснейтрализующей активности сыворотки. Титр вируснейтрализующих антител выражали через индекс нейтрализации (ИН), в логарифмических единицах.
Результаты сравнительного исследования напитка «Ваше здоровье» по лечебной схеме при пероральном введении. В таблице 1 приведены данные исследования противовирусной активности напитка «Ваше здоровье» при использовании у самцов морских свинок по лечебной схеме через 48 часов после инфицирования вирусом простого герпеса.
Первая группа
Максимальное развитие симптоматики в контрольной группе животных, получавших физиологический раствор отмечали на 5-е сутки после инфицирования (СИВС равен 62,5 баллам). С 7-х суток отмечали генерализацию процесса у части инфицированных животных (у 2 из 5 свинок), сопровождающуюся повышением температуры тела, вялостью, адинамичностью, нарушением функций тазовых органов, парезом конечностей. Среднее время появления признаков генерализации ГИ составило 7,0±0 суток. На 10-е сутки после инфицирования отмечали гибель 1 особи от генерализованной ГИ, которая была подтверждена вирусологическими методами исследования (выявление специфического ВПГ-антигена в мазках-отпечатках головного мозга при некропсии). К 22 суткам после инфицирования у животного, перенесшего генерализованную ГИ, наблюдалось восстановление функции тазовых органов и двигательной активности (при частичном сохранении парезов). Средняя продолжительность заболевания составила 17,25±4,43 суток (см. табл.1).
Вторая группа
Применение напитка «Ваше здоровье» у животных через 48 часов после заражения приводило к статистически достоверному снижению СИВС и сокращению средней продолжительности заболевания (в среднем на 6,3 суток) по сравнению с аналогичными показателями в контроле инфицирования. ИЛД напитка в данных условиях эксперимента составил 21,6 %. Средняя продолжительность заболевания (СПЗ) у животных, получавших напиток, составила 11,0±1,16 суток. Развитие генерализованного процесса отмечали у 1 животного на 7-е сутки после инфицирования. Среднее время появления признаков генерализованной ГИ составило 7,0±0 суток. На 12-е сутки после инфицирования отмечали гибель 1 особи от генерализованной ГИ, подтвержденной вирусологическими методами исследования. Гибель от генерализованной ГИ, как и в контрольной группе животных, составила 20%, однако наступала на двое суток позже, чем у животных, получавших физиологический раствор.
Третья группа
Применение референс-препарата Zovirax у животных через 48 часов после заражения приводило к статистически достоверному снижению СИВС и сокращению средней продолжительности заболевания (в среднем на 6,75 суток) по сравнению с аналогичными показателями в контроле инфицирования. ИЛД препарата Zovirax в данных условиях эксперимента составил 38,4%, СПЗ – 10,8± 1,5 суток. Развитие генерализованного процесса не отмечали ни у одного инфицированного животного в течение всего периода наблюдения. При сравнении эффективности напитка «Ваше здоровье» (2-я группа) и препарата Zovirax (3-я группа) отмечено, что напиток сопоставим с Zovirax по влиянию на среднюю продолжительность заболевания у инфицированных животных (11,0±1,16 суток и 10,8±1,5 суток соответствено). Разница в терапевтическом воздействии между напитком и Zovirax составляет 16,8% . Более подробно сравнительные показатели представлены в таблице 1. Одновременно с определением влияния напитка и препарата Zovirax на течение экспериментальной герпетической инфекции гениталий у самцов морских свинок, мы изучали у последних продукцию специфических вируснейтрализующих антител. Как видно из данных, представленных в таблице 2., через 14 дней от начала инфицирования, уровень вируснейтрализующих антител (ВА) в крови инфицированных животных, получавших лечение с использованием вышеуказанных препаратов, регистрировался в диапазоне от 3,0 до 3,5 lg - при их пероральном способе введения. Титры ВА у животных, принимавших напиток или Zovirax , не превышали уровень антител, индуцированный у животных только вирусом. Разница в индексе нейтрализации у животных контрольной и опытных групп был статистически не достоверной. На основании полученных результатов, можно предположить, что использованные нами препараты не влияют на формирование гуморального иммунитета против вируса простого герпеса и поддерживают его на уровне умеренной напряженности. Таким образом, в результате проведенного эксперимента установлено, что напиток «Ваше здоровье» при использовании по лечебной схеме при пероральном способе введения на модели генитального герпеса у морских свинок обладает достоверным противовирусным эффектом, позволяющим подавлять развитие ГИ, обусловленной ВПГ. Напиток сопоставим с референс - препаратом Zovirax по влиянию на среднюю продолжительность заболевания, незначительно уступая последнему по ИЛД и СИВС.
В связи с тем, что у части инфицированных животных, после перенесенной острой инфекции, наблюдалось развитие спонтанных рецидивов, целесообразно изучение эффективности напитка по лечебной схеме не только в период острой инфекции, но и перед наступлением возможного рецидива.
ВЫВОДЫ
1. Напиток «Ваше здоровье» обладает достоверной противовирусной активностью и оказывает ингибирующее действие на ВПГ-2.
2. Напиток «Ваше здоровье» статистически достоверно сопоставим с референс - препаратом Zovirax по влиянию на среднюю продолжительность заболевания, незначительно уступая последнему по ИЛД, СИВС и влиянию на развитие генерализованной герпесвирусной инфекции.
3. Использованные препараты не влияют на формирование гуморального иммунитета против вируса простого герпеса и поддерживают его на уровне умеренной напряженности.

Литература:
1. Алимбарова Л.М., Баринский И.Ф., Кузьмин К.К. Экспериментальная оценка противовирусной активности новых лекарственных форм фоскарнета на модели генитального герпеса морских свинок// Вопр. Вирусол.- 1998. –т.43.-№2 .- с.82-86.
2. Маренникова С.С., Мацевич Г.Р., Чекунова Э.В. и др. Разработка и практическое использование новых экспериментальных моделей разных форм герпетической инфекции// Вопр. вирусол.-1986.-№1.-С.59-65.
Таблица 1. Эффективность напитка «Ваше здоровье» на модели герпесвирусной инфекции гениталий у самцов морских свинок при пероральном способе введения.

Таблица 2. Титры вируснейтрализующих антител в сыворотке крови экспериментально инфицированных ВПГ-2 самцов морских свинок, получавших напиток «Ваше Здоровье» и референс-препарат Zovirax при пероральном введении, по данным реакции нейтрализации in vitro.